Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Das genetische Potential eines Standortes (z. B. Sediment, Boden, Habitate extremophiler Mikroorganismen) soll in seiner Gesamtheit zur Erzeugung von rekombinanten Organismen mit speziellen Eigenschaften ausgenutzt werden. Dabei sollte die erw\u00fcnschte Eigenschaft oder F\u00e4higkeit jeweils durch die Auswahl des sich anschlie\u00dfenden Screeningverfahrens bestimmt werden. Hierdurch wird eine Anwendung von einmalig angelegten Standortgenbanken auf unterschiedliche Zielsetzungen gew\u00e4hrleistet. Ziel des Projektes ist es, mit Hilfe des dargestellten Systems industriell relevante und neuartige Enzyme mit vorher festgelegten Eigenschaften zu identifizieren. Hierbei wurde angestrebt, biotechnologisch interessante Amylasen und Lipasen\/Esterasen zu isolieren.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZur Anlegung von Standortgenbanken wurde die DNA aus Boden- und Sedimentproben folgender Standorte isoliert: Zuckerr\u00fcbenfeld (N\u00f6rten-Hardenberg, Deutschland), Wiese (Northeim, Deutschland), Kartoffelacker (Harz, Deutschland), vulkanischer Boden (Oregon, USA), Sediment des Flusses Nieme (Deutschland), Boden (Sinai, \u00c4gypten), Sediment (Totes Meer, Israel), Salzgewinnungsanlage (Lanzerote, Spanien), Wasserboiler, Schwimmbad G\u00f6ttingen. Die gereinigte Standort-DNA wurde jeweils verdaut, gr\u00f6\u00dfenfraktioniert und ligiert. Als Wirt wurde daf\u00fcr Escherichia coli und als Vektoren Plasmide, BACs und Cosmide verwendet. Anschlie\u00dfend wurde durch Bestimmung der durchschnittlichen Insertgr\u00f6\u00dfe und des Anteils der Klone mit Insert die Qualit\u00e4t der Genbanken \u00fcberpr\u00fcft. Die Erhaltung und Amplifikation der Genbanken erfolgte ebenfalls in E. coli. Die DNA-Manipulationen, Sequenzierungen und Klonierungen wurden anhand von Standardmethoden durchgef\u00fchrt.
\nNeu angelegte und bereits vorhandene Genbanken wurden auf die Anwesenheit von Genen f\u00fcr Lipasen\/Esterasen und a-Amylasen gescreent. Hierf\u00fcr wurden Plattenschnelltestverfahren verwendet. Im Falle der Lipasen\/Esterasen erfolgte das Screening der rekombinanten E. coli-St\u00e4mme auf Triolein-(Lipasesubstrat) bzw. Tributyrin (Esterasesubstrat)-haltigen Vollmediumsplatten. Die Identifizierung von E. coli-Klonen mit Genen f\u00fcr a-Amylasen wurde auf St\u00e4rke-Azur-Minimalplatten durchgef\u00fchrt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Zur Auffindung von industriell relevanten Enzymen mit neuartigen Eigenschaften wurde ein neu entwickeltes Verfahren angewendet, das unabh\u00e4ngig von der Kultivierbarkeit der Mikroorganismen das ge-samte genetische Potential eines Standortes ausnutzt. Es wurden bisher 16 Standort-Genbanken angelegt. Die Gesamt-DNA wurde hierzu aus verschiedenen Standorten durch direkte DNA-Extraktion isoliert. Die erhaltene Standort-DNA wurde partiell gespalten und in Vektoren kloniert. Zur Charakterisierung der Genbanken wurde die durchschnittliche Insertgr\u00f6\u00dfe bestimmt. Die ermittelten Werte lagen bei 3 bis 8,5 kb f\u00fcr Plasmide, 30 bis 60 kb f\u00fcr Cosmide und 100 bis 120 kb f\u00fcr BACs Die angewendete Methode erwies sich daher als geeignet, um Genbanken aus Standortproben in den 3 verwendeten Vektortypen zu erstellen.
\nEs wurden 3 verschiedene Standortgenbanken auf die Anwesenheit von Lipase\/Esterase-Genen getestet. Insgesamt wurden 1,016.000 E. coli-Klone gescreent und dabei 4 Klone (E. coli\/pAH110-113) mit stabilem Ph\u00e4notyp erhalten und intensiv molekularbiologisch und biochemisch untersucht. Zun\u00e4chst wurden die DNA-Bereiche, die f\u00fcr die Lipase\/Esterase kodieren, identifiziert. Die Sequenzanalyse der aus den 4 subklonierten Genen abgeleiteten Proteine (LipA, Orf111, Orf112 und Orf113) zeigte, dass alle \u00fc-ber die f\u00fcr Lipasen\/Esterasen typische Konsensussequenz im Bereich des Serins im aktiven Zentrum der Enzyme verf\u00fcgen. Homologievergleiche mit bekannten Sequenzen f\u00fcr Lipasen\/Esterasen best\u00e4tigten die Zugeh\u00f6rigkeit aller 4 Proteine zur Lipase\/Esterase-Familie. Eine geringe aber signifikante \u00c4hnlichkeit \u00fc-ber die ganze L\u00e4nge des Proteins konnte nur bei LipA festgestellt werden. Zur Charakterisierung von Li-pA, Orf111, Orf112 und Orf113 wurde die Substratspezifit\u00e4t mit folgenden Triglyceriden als Testsubstraten bestimmt: Tributyrin, Tricaproin, Tricaprylin, Tricaprin, Trilaurin und Triolein. Das von E. coli\/pAH110 produzierte LipA-Protein war in der Lage, alle eingesetzten Triglyceride zu spalten, und besitzt demnach das gr\u00f6\u00dfte biotechnologische Potential. Die von den anderen drei rekombinanten E.coli-St\u00e4mmen gebildeten Proteine (Orf111, Orf112, Orf113) konnten nur das Esterase-spezifische Substrat Tributyrin umsetzen.
\nF\u00fcr das Screeningverfahren auf a-Amylase Aktivit\u00e4t wurde ein Plattenschnelltestverfahren (St\u00e4rkeazur als Testsubstrat) angewendet. Bei der Durchmusterung von 3 Genbanken in Cosmiden und BAC-Vektoren wurden bisher 34 positive E. coli-Klone mit stabiler Amylase-Aktivit\u00e4t erhalten. Hiervon wurden f\u00fcr 4 Cosmide (CosG\u00f61 bis CosG\u00f64) die a-Amylase-Aktivit\u00e4t auf eine biotechnologische Anwendung hin charakterisiert. Dabei zeigte die Aktivit\u00e4t, die von CosG\u00f63 vermittelt wird, durchaus Industriepotential. Die 4 Inserts der Cosmide CosG\u00f61 bis CosG\u00f64 wurden vollst\u00e4ndig sequenziert und die potentiellen offenen Leserahmen, die f\u00fcr den Ph\u00e4notyp verantwortlich sind (amy1 bis amy5), identifiziert und in Expressionsvektoren kloniert. Die vollst\u00e4ndige biochemische Charakterisierung der gereinigten, heterolog exprimierten Enzyme erfolgt zur Zeit.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Ergebnisse \u00fcber das Screening der Umweltgenbanken auf Lipase-Gene wurden im Mai 1999 beim 99th General Meeting of the American Society for Microbiology in Chicago (USA) und ASM-Konferenz f\u00fcr Biodegradation, Biotransformation, and Biocatalysis in Puerto Rico (USA) 2001 pr\u00e4sentiert. Diese Ergeb-nisse sind in einer Publikation von Henne, A., R. A. Schmitz, M. B\u00f6meke, G. Gottschalk, and R. Daniel mit dem Titel Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli in Appl. Environ. Microbiol. (2000) 66:3113-3116.
\nDie erzielten Ergebnisse \u00fcber die identifizierten Amylasen wurden zum Teil auf der 7th symposium on bacterial Genetics and Ecology Tagung in Bergen (Norwegen) 2002 als Poster vorgestellt. Nach der vollst\u00e4ndigen biochemischen Charakterisierung der 5 identifizierten neuartigen Amylasen, werden die Ergebnisse in einer Publikation ver\u00f6ffentlicht.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die hier dargestellten Ergebnisse in Bezug auf die Klonierung von Genen f\u00fcr Lipasen\/Esterasen\/Amylasen zeigen, dass die angewendete Vorgehensweise erfolgreich ist und durch Screening von Umweltgenbanken neue Enzyme gefunden werden k\u00f6nnen. Dies wurde durch die molekulare und biochemische Charakterisierung der identifizierten Lipasen\/Esterasen best\u00e4tigt.
\nFerner zeigte sich, dass sich die beschriebene Methodik zur Anlegung von Genbanken nicht nur in Plasmiden sondern auch in Cosmiden und BAC-Vektoren eignet. Ferner belegten diese Untersuchungen, dass die verwendete Methodik sich zur Identifizierung von Proteinen anderer Industriell-relevanter Enzymklassen eignet.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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