Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Zuckerr\u00fcben unterliegen nach Frostsch\u00e4digung in Abh\u00e4ngigkeit von der Lagertemperatur mikrobiellen Ver\u00e4nderungen. Die dabei auftretende Dextranbildung st\u00f6rt den Zuckergewinnungsprozess, insbesondere die Filtrationsschritte, erheblich. Durch Einsatz von Dextranase l\u00e4sst sich die Verarbeitungsleistung halten und die durch die fortschreitende Minderung der Rohstoffqualit\u00e4t auftretenden Effekte bez\u00fcglich Energie- und Ressourcenverbrauch minimieren. Die zurzeit zug\u00e4nglichen Dextranasen sind jedoch auf Grund ihrer geringen Aktivit\u00e4t bzw. schnellen Inaktivierung bei \u00fcblichen Prozesstemperaturen nur bedingt geeignet. Zielsetzung des Vorhabens war, Vorarbeiten zur Herstellung einer f\u00fcr die Belange der Zuckerindustrie ma\u00dfgeschneiderten Dextranase durchzuf\u00fchren.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie gew\u00e4hlten Arbeitsschritte lassen sich in drei Gruppen unterteilen:
\n1.\tSelektion und klassische Mutagenese: Screening nach Dextranase-produzierenden Mikroorganismen (Proben aus einer Zuckerfabrik), Auswahl des Stamms, Anzucht von Chaetomium gracile, Mutagenese, Medienoptimierung.
\n2.\tGentechnologische Arbeitsweise: Herstellung von Dextranase-positiven Klonen ausgehend von dem thermophilen Dextranase exprimierenden Thermoanaerobacterium FH1 bzw. von 4 Umweltgenbanken: Isolation und Reinigung der DNA, Klonierung in E. coli, Charakterisierung und Anlegen einer Gesamtgenbank, Screening auf Dextranase.
\n3.\tPr\u00fcfung von Dextranasepr\u00e4paraten auf ihre Eignung zum Einsatz in der Zuckerindustrie: Vergleichende Messung der Aktivit\u00e4t durch Beobachtung der Bildung reduzierender Zucker aus Dextran und durch Beobachtung der Viskosit\u00e4tsabnahme in einer Dextranl\u00f6sung nach Enzymzusatz, Simulation des Prozessschritts Saftreinigung im Labor, Pr\u00fcfung auf unerw\u00fcnschte Nebenaktivit\u00e4ten.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Selektion und Mutagenese
\nIn Fl\u00fcssigkultur zeigte C. gracile eine deutlich h\u00f6here Dextranase-Bildung im Vergleich zu den zwei nach dem Screening ausgew\u00e4hlten Mikroorganismen. Daher wurde C. gracile f\u00fcr die weiteren Mutations- und Optimierungsarbeiten ausgew\u00e4hlt. Es gelang, eine Mutante zu isolieren, deren Wachstum auf der Blue-Dextran-Agarplatte eine erh\u00f6hte Dextranasebildung im Vergleich zum Wildstamm erwarten lie\u00df. Zur Fermentation mit dieser Mutante wurde eine Medienoptimierung durchgef\u00fchrt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei dem Einsatz von Stressfaktoren und der Vermeidung von Dextran als Substratbestandteil gewidmet. Als Stressfaktoren erwiesen sich Kalium- und Natriumchlorid als die wirksamsten Mittel zur Erh\u00f6hung der Enzymausbeuten. Beide Substanzen f\u00fchrten nach der Zugabe nach drei Tagen Wachstum zu einer Ausbeuteerh\u00f6hung um den Faktor 1,5 bis 2. Auf Dextran als Substratbestandteil konnte jedoch nicht verzichtet werden. Die \u00fcber diesen Weg gewonnene Dextranase zeigte im Vergleich zu zwei kom-merziell erh\u00e4ltlichen Pr\u00e4paraten sehr \u00e4hnliche Eigenschaften bez\u00fcglich Temperaturoptimum und -stabilit\u00e4t sowie Aktivit\u00e4t bei Bedingungen, die den technischen m\u00f6glichst weit angen\u00e4hert wurden. Auch in einer simulierten Saftreinigung erwiesen sich die Pr\u00e4parate in gleicher Weise geeignet, Dextran abzubauen um Filtrationsprobleme zu vermeiden. St\u00f6rende Nebenaktivit\u00e4ten (Saccharose-, Pektinabbau) wurden nicht festgestellt.
\nGentechnologische Arbeiten
\nEs wurden etwa 20.000 rekombinante E. coli-St\u00e4mme mit Inserts aus FH1-DNA getestet. Dies entspricht statistisch einer zu 99,99 % vollst\u00e4ndigen Genbank. Es konnte jedoch noch kein Dextranase-positiver Klon identifiziert werden. Ein Grund f\u00fcr den bisher mangelnden Erfolg liegt wahrscheinlich darin, dass die verwendete Screeningmethode auf der Produktion von aktiver Dextranase in E. coli beruht. Es ist m\u00f6glich, dass die Dextranase aus FH1 nur gering oder \u00fcberhaupt nicht von E. coli ohne weitere genetische Manipulationen produziert werden kann. Alternativ zu der beschriebenen Screeningmethode wollten wir daher eine Identifizierung des Dextranase-Gens aus FH1 in den angelegten Genbanken durch Koloniehybridisierung vornehmen. Als heterologe DNA-Sonden wurden bereits beschriebene Dextranase-Gene verwendet. Mit diesen Sonden zeigten sich keine Signale mit der chromosomalen FH1-DNA. Diese Sonden sind daher f\u00fcr einen Einsatz in einer Koloniehybridisierung ungeeignet. Etwa 560.000 E. coli-Klone aus Standortgenbanken wurden auf die Anwesenheit von Genen f\u00fcr thermostabile Dextranasen durchmustert. Hierbei wurden bisher 5 positive E. coli-Klone identifiziert. Aus diesen wurden die rekombinanten Plasmide isoliert und zur Best\u00e4tigung des Dextranase-positiven Ph\u00e4notyps retransformiert. Zur Identifizierung der Dextranase-Gene werden die Inserts dieser Plasmide sequenziert und die entsprechenden Gene subkloniert. Parallel zu diesen Arbeiten wurde mit FH1 fermentiert, um FH1-Dextranase auf ihre Eigenschaften zu untersuchen. Es wurde ein Pr\u00e4parat mit sehr geringer Enzymaktivit\u00e4t hergestellt, dass sich jedoch als temperaturstabil erwies.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Ein Teil der hier beschriebenen Ergebnisse \u00fcber die Isolierung und Charakterisierung des Dextranase-Produzenten FH1 wurde im M\u00e4rz 1999 im Rahmen der Jahrestagung der VAAM (Vereinigung f\u00fcr Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie) in Form eines Posters pr\u00e4sentiert. Anl\u00e4sslich der Biotechnica in Hannover (5. Bis 7.10.1999) wurden das Projektkonzept und Teilergebnisse im Rahmen eines Vortrags vorgestellt. Eine Publikation \u00fcber diese Ergebnisse ist ebenfalls in Vorbereitung.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Zielsetzung, ein Dextranasepr\u00e4parat bereitzustellen, dass h\u00f6here Stabilit\u00e4t bei technischen Bedingungen aufweist als die bisher technisch zug\u00e4nglichen Pr\u00e4parate, ist nicht erf\u00fcllt. Dazu m\u00fcsste das Enzym aus C. gracile auf gentechnischem Weg modifiziert werden. Das FH1-Enzym zeigte die gew\u00fcnschte Temperaturstabilit\u00e4t; sein Gen konnte jedoch in E.coli-Klonen nicht identifiziert werden. Andere methodische Ans\u00e4tze m\u00fcssen gefunden werden. Ob \u00fcber die aus den Umweltgenbanken identifizierten Dextranasegene ein Dextranasepr\u00e4parat mit gew\u00fcnschten Eigenschaften zug\u00e4nglich sein wird, kann nur nach Weiterf\u00fchrung der Arbeiten entschieden werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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