Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Im komplexen Geschehen der chemischen Kanzerogenese stellt die Bindung der Fremdstoffe an die DNA den ersten entscheidenden Schritt dar. Welchen Anteil die Belastung mit Kanzerogenen, besonders solchen aus der Umwelt, an den Krebserkrankungen des Menschen hat, ist nach wie vor umstritten und kann weder durch epidemiologische Untersuchungen noch durch generelles Umweltmonitoring ausreichend gekl\u00e4rt werden. Das 32P-Postlabeling von DNA-Addukten ist das empfindlichste Verfahren f\u00fcr das Biomonitoring der menschlichen Belastung mit Kanzerogenen. Mit den bisher angewandten analytischen Trennmethoden, D\u00fcnnschichtchromatographie, DC, und Hochdruckfl\u00fcssigkeitschromatographie, HPLC, gelingt die sichere Identifizierung von Belastungen mit Umweltchemikalien nicht befriedigend. In unserem Projekt soll deshalb als neue Trenntechnik die Kapillarelektrophorese erprobt werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie von uns entwickelte HPLC-Blotting-Methode f\u00fcr die Bestimmung von 32P-markierten DNA-Addukten soll auf die Bedingungen der Kapillarelektrophorese \u00fcbertragen werden. Drei Schwerpunkte der Entwicklungsarbeit sind zu nennen. (1) Die Auftragung ausreichend hoher Fl\u00fcssigkeitsmengen in die Kapillare, damit die gelabelten Proben (10-20 \u00b5l) verlustfrei chromatographiert werden k\u00f6nnen. Hierzu bestehen bereits eine Reihe von Verfahren, die auf unsere Addukte \u00fcbertragen und optimiert werden m\u00fcssen. (2) Die Erarbeitung von Trennbedingungen f\u00fcr die verschiedenen in der Umwelt zu erwartenden Addukte. Hier kommt uns unsere Erfahrung mit DNA-Addukten verschiedenster chemischer Natur und die Zu-sammenarbeit mit einer Reihe von Kollegen aus dem In- und Ausland zugute. (3) Die Technik f\u00fcr das Blotting des Eluats der Kapillare mu\u00df entwickelt werden. Wichtig ist bei der Kapillarelektrophorese die Aufrechterhaltung des Spannungsunterschieds zwischen Kapillareingang und Kapillarende. Sobald diese technischen und analytischen Probleme gel\u00f6st sind, werden wir daran gehen humane Proben auf DNA-Addukte zu untersuchen. Mit Hilfe der hohen Trennleistung der Kapillarelektrophorese sollte es gelingen eine Art Fingerprint zu bekommen. Unterschiede zwischen Gesunden und Tumorpatienten k\u00f6nnten dann Hinweise auf die Beteiligung von chemischen Kanzerogenen in der Krebsentwicklung geben.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die in diesem Projekt entwickelte Blottingmethode mit der Kapillarzonenelektrophorese erm\u00f6glicht eine sehr selektive und sensitive Analyse von DNA-Addukten nach 32P-Postlabeling. Mehrere DNA-Adduktanalysen von Standardverbindungen und Leber- bzw. Herz-DNA von mit Schadstoffen behandelten Ratten belegen die Leistungsf\u00e4higkeit dieses Systems. Der Vorteil gegen\u00fcber der D\u00fcnnschichtchromatographie liegt in der h\u00f6heren Reproduzierbarkeit der Me\u00dfergebnisse und der m\u00f6glichen Mehrfachinjektion ei-ner Probe. Die langsameren Migrationsgeschwindigkeiten der Nukleotide im Vergleich zu denen der Nukleotidaddukte stellt einen weiteren Vorteil gegen\u00fcber HPLC-Techniken und der DC dar. Der vielfache \u00dcberschu\u00df an adduktfreien Nukleotiden und die ungew\u00fcnschten Anlagerungsprodukte von [g-32P]-ATP an Komponenten der Reaktionsmischung wirken sich deshalb nicht st\u00f6rend auf die Analyse der Addukte aus und machen Vors\u00e4ulenschaltungen (HPLC) und zeitintensive Waschschritte (DC) \u00fcberfl\u00fcssig. Die etwas schlechtere Sensitivit\u00e4t gegen\u00fcber der DC (ungef\u00e4hr Faktor 10) h\u00e4ngt mit dem geringen Injektionsvolumen bei der CE (ca. 50 nl) zusammen. Durch Aufkonzentrierungsverfahren (electrostacking) k\u00f6nnte bis zu 1 \u00b5l Probe injiziert und die Nachweisgrenze deutlich verbessert werden. Wegen der hohen Salzkonzentration in der Probe und den schlechten Retardationseigenschaften an den station\u00e4ren Phasen von Festphasenkartuschen konnte dieses Ziel bisher noch nicht erreicht werden. In Verbindung mit modernen Anreicherungsverfahren f\u00fcr Addukte wie z.B. die Immunaffinit\u00e4tschromatographie sollte es jedoch gelingen, die notwendige
\nNachweisempfindlichkeit zu erreichen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse wurden als Poster (Nr. 113) auf einer internationalen Fachtagung f\u00fcr Kapillarelektrophorese vorgestellt und als Publikation der Analytical Chemistry vorgelegt:
\nSchmitz O.; Richter E.; Capillary Zone Electrophoresis with On-Line Blotting for Separation and Detection of 32P-Postlabeled DNA-Adducts. 12th International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis & Related Microscale Techniques, Palm Springs, CA, 23.-28. 01.1999
\nSchmitz O.; Richter E.; Capillary zone electrophoresis with on-line blotting for separation and detection of 32P?postlabeled DNA adducts, Anal. Chem., submitted<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die von uns entwickelte Blottingmethode kombiniert die hohe Selektivit\u00e4t der Kapillarzonenelektrophorese mit der Sensitivit\u00e4t der TLC und stellt momentan nach der TLC die empfindlichste Analysenmethode zur Bestimmung von DNA-Addukten dar. Sollten weiterf\u00fchrende Arbeiten eine Probenanreicherung durch eine Art des Elektrostackings erm\u00f6glichen, k\u00f6nnte die Empfindlichkeit noch weiter verbessert werden. Desweiteren zeigt unsere Blottingmethode noch andere Vorteile auf, indem man beispielsweise DNA-Addukte mit einem Fluoreszenzmarker anstelle des [g-32P]-ATP labelt und die auf dem Filterpapier geblotteten Addukte mit einer CCD-Kamera bestrahlt und die resultierende Fluoreszenz \u00fcber mehrere Minu-ten mi\u00dft. Dies k\u00f6nnte gegen\u00fcber herk\u00f6mmlichen CE-Analysen mit einem Laser-induzierten-Fluoreszenzdetektor zu einer deutlichen Steigerung der Empfindlichkeit f\u00fchren. Allerdings m\u00fc\u00dfte zuerst ein Ersatz f\u00fcr das zum Blotten verwendete Filterpapier gefunden werden, da die Eigenfluoreszenz von Papier eine empfindliche Fluoreszenzmessung unm\u00f6glich macht.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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