Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Mit dem ersten Auftreten 1992 der toxischen Diatomee Pseudo-Nitzschia pungens forma multiseries in Gew\u00e4ssern des Wattenmeers ergab sich die Notwendigkeit, Nachweismethoden f\u00fcr das gebildete Toxin Domoins\u00e4ure zu entwickeln. Dabei sollte versucht werden, apparativ wenig aufw\u00e4ndige Verfahren zu entwickeln. Diese Verfahren sollten intrinische molekulare Eigenschaften des Toxins nutzen. In der Vorphase des Vorhabens gelang es, entsprechende colorimetrische Nachweismethoden mit D\u00fcnn-schichtchromatographie zu kombinieren. In der Hauptphase wurde dieses Verfahren zur Anwendungs-reife f\u00fcr die Untersuchung von realen Proben weiterentwickelt.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie bislang an definierten Standards (ausgew\u00e4hlte Aminos\u00e4uren, Domoin- (DA) und Kainins\u00e4ure) erfolgreiche Trennung in toxische und nichttoxische Substanzen wurde auf komplexere Gemische aus nat\u00fcrlichen oder natur\u00e4hnlichen Proben ausgeweitet. Hierzu z\u00e4hlen u. a. in den zur DA-Extraktion benutzten L\u00f6sungsmitteln ebenfalls l\u00f6sliche Lipide und andere Aminos\u00e4uren bzw. kurzkettige Peptide. Ein Reinigungsschritt hierf\u00fcr wurde optimiert. In diesem Schritt werden kommerziell erh\u00e4ltliche Adsorptionskartu-schen eingesetzt, um unpolare Verunreinigungen aus Gesamtextrakten zu entfernen.
\nUm toxinhaltige Miesmuscheln in ausreichender Menge zur Verf\u00fcgung zu haben, wird die verursachende Kieselalge in gr\u00f6\u00dferen Ans\u00e4tzen kultiviert. Die erhaltene Algensubstanz wird nach Bestimmung des Toxingehalts an Muscheln in Aquarienh\u00e4lterung verf\u00fcttert. Besonders die Algenkultivierung war relativ zeitaufw\u00e4ndig und bedurfte st\u00e4ndiger Kontrolle.
\nNach einer Reihe von Versuchen gelang es, DA von anderen Aminos\u00e4uren mit D\u00fcnnschichtchromatographie an Umkehrphase (C18) abzutrennen. Eine selektive Detektion gelang mit Natriumnitroprussid.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die in der Vorphase des Projekts entwickelten Reaktoren zur Z\u00fcchtung gr\u00f6\u00dferer Mengen toxischer Diatomeen wurden erfolgreich weiter genutzt. Um ausreichende Mengen toxinhaltiger Miesmuscheln zur Verf\u00fcgung zu haben, wurden die Algen in einfachen Laborans\u00e4tzen an die Muscheln verf\u00fcttert.
\nZun\u00e4chst wurden die Extraktionsverfahren und die Aufreinigungsschritte, die vor allem bei der Analyse kontaminierter Muscheln notwendig sind, optimiert. Dabei zeigte sich, dass Festphasenextraktion \u00fcber Anionenaustauschharze am besten geeignet sind, st\u00f6rende Begleitkomponenten aus der Matrix zu entfernen. Dabei werden in der Regel Wiederfindungsraten von \u00fcber 90 % erzielt.
\nWegen der nicht unerheblichen Kosten beim Einsatz dieser Extraktionskartuschen wurde untersucht, inwieweit sich diese Einmalkartuschen, gegebenenfalls nach Reinigung, wieder verwenden lassen. Es zeigte sich, dass dies m\u00f6glich ist, solange die Absorberharze nicht verf\u00e4rbt sind.
\nVon den verschiedenen Extraktionsmitteln erwies sich Methanol\/Acetatpuffer als am besten geeignet, um das Toxin aus der komplexen Matrix Muschelfleisch nahezu quantitativ zu erhalten.
\nAusgehend von den Ergebnissen der Vorphase wurde die d\u00fcnnschichtchromatographische Abtrennung der Toxine von anderen im aufgereinigten Extrakt enthaltenen Verbindungen, z. B. freie Aminos\u00e4uren, weiter optimiert. Dabei erwies sich eine C18-Umkehrphase als am besten geeignet. Als Nachweisrea-gens wurde Natriumnitroprussid eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass es spezifisch mit Imino- und Prolylaminos\u00e4uren zu einem blauen Farbstoff reagiert. Daneben kann Vanillin eingesetzt werden, das orange-gelben Farbstoff ergibt. Die gereinigten (s.o.) Extrakte aus Muscheln wurden zun\u00e4chst mit HPLC quantitativ auf ihren Toxingehalt untersucht. F\u00fcr Planktonproben erwies sich eine Reinigung als nicht notwendig. Parallel dazu wurde an denselben Proben die optimierte DC durchgef\u00fchrt, um die Nachweisgrenze zu bestimmen.
\nBeide verwendeten Regantien haben Nachweisgrenzen von 20 \u00b5g DA\/mL Rohextrakt bzw. 9 \u00b5g DA\/mL gereinigtem Extrakt. Eine eindeutige Ja\/Nein-Aussage ist noch bei Konzentrationen von 9 bzw. 0,9 \u00b5g DA\/mL m\u00f6glich. Damit liegen die Nachweisgrenzen unter den von der WHO geforderten 21 \u00b5g\/g Muschelfleisch (= 13 \u00b5g\/mL aufgereinigter Extrakt).
\nDas entwickelte Verfahren ist damit geeignet, als Routinemethode f\u00fcr semiquantitative Voruntersuchungen auf Domoins\u00e4urekontamination verwendet zu werden. Es kann als erheblich kosteng\u00fcnstigere Alternative in der Lebensmittel\u00fcberwachung eingesetzt werden, muss aber bei positiven Befunden durch eine quantitative Bestimmung mit HPLC erg\u00e4nzt werden.
\nEin Teil der beschriebenen Arbeiten wurde in Kooperation mit Dr. Roger Pocklington, Bedford Institute of Oceanography, Dartmouth, Nova Scotia, Canada, durchgef\u00fchrt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Arbeiten wurden 1997 auf dem Jahrestreffen der Kanadischen Chemischen Gesellschaft vorgestellt und diskutiert.
\nEine Publikation \u00fcber die Endergebnisse ist in Vorbereitung.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Ziele des Vorhabens wurden damit erreicht.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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