Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Beurteilung der biologischen Toxizit\u00e4t zur Kontrolle von Oberfl\u00e4chen- und Abwasser mit einfachen und automatisierten Testsystemen gewinnt zunehmend an Bedeutung. Die Untersuchung der biologischen Toxizit\u00e4t als Umweltparameter mit universeller Einsetzbarkeit kann einfach durch die Messung der mikrobiellen Stoffwechselaktivit\u00e4t von Testorganismen erfolgen. Ziel der Vorphase war die Weiterentwicklung des bestehenden Biosensors zur Detektion mikrobieller Stoffwechselaktivit\u00e4t \u00fcber den Energiemetaboliten ATP und bestimmte Testorganismen auf ihre Anwendbarkeit bei unterschiedlichen Messproblemen auszuw\u00e4hlen und auf ihre Eignung zu untersuchen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZun\u00e4chst wurde die Auswahl der Organismen getroffen und ihre Eignung als Testorganismen f\u00fcr die Bestimmung der biologischen Toxizit\u00e4t \u00fcberpr\u00fcft. Dabei wurde insbesondere die DIN 38412 zur Bestimmung der biologischen Toxizit\u00e4t ber\u00fccksichtigt. Die ausgew\u00e4hlten Testorganismen waren Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli K12 und weitere Mikroorganismen (Kl\u00e4rwerksproben). Durch vergleichende Untersuchungen mit den etablierten Methoden der Tr\u00fcbungsmessung, Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten und Atmungsmessungen wurde die Aussagekraft der biosensorischen ATP-Bestimmung f\u00fcr Stoffwechselaktivit\u00e4t und Wachstum untersucht. Die f\u00fcr diesen Zweck ausgew\u00e4hlten Referenztoxine waren Zinksulfat, Kaliumdichromat und Dichlorphenol. Au\u00dferdem wurde die Handhabung der Mikroorganismen bez\u00fcglich Bevorratung\/Fermentierung im Bioreaktor und der notwendigen Inkubationsdauer mit der Probe untersucht. Die Effizienz des erforderlichen Zellaufschlusses zur Bestimmung des intrazellul\u00e4ren ATP-Gehaltes und die Aussagekraft des Detektionssignals wurden \u00fcberpr\u00fcft. Der Laboraufbau des Sensorsystems mit den Funktionskomponenten Inkubation, Zellaufschluss und Detektion wurde im Hinblick auf Analysegeschwindigkeit, Stoffstr\u00f6me und Haltbarkeit der Enzymkomponente des Flie\u00df-Infektions-Analyse-(FIA)Systems f\u00fcr eine zuverl\u00e4ssige Handhabung weiterentwickelt und mit einer Rechnersteuerung ausgestattet.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die anwendungsrelevanten Untersuchungen eines Biosensors bestehen naturgegeben aus der biologisch\/biochemischen und der technischen Komponente.<\/p>\n
Biologisch\/biochemische Komponente
\nDie \u00dcberpr\u00fcfung, ob in den ausgew\u00e4hlten Testorganismen ATP gemessen werden kann und ob die Bestimmung von ATP im Vergleich mit den etablierten Methoden der Tr\u00fcbungsmessung (OD), der Atmungsmessung und der Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) eine geeignete Methode zur Erfassung der biologischen Toxizit\u00e4t darstellt, ergab folgende Ergebnisse:<\/p>\n
1. ATP ist bei allen o.g. Organismen und bei Ustilago maydis, Bacillus stearothermophilus TP32, Micrococcus luteus und Mischkulturen wie Belebtschlamm gut messbar und liefert auch im Hinblick auf die etablierten Methoden gleichwertige und z.T. noch aussagekr\u00e4ftigere Ergebnisse. Es konnte gezeigt werden, dass der f\u00fcr die ATP-Freisetzung erforderliche vollst\u00e4ndige Zellaufschluss von gleichbleibend hoher Qualit\u00e4t ist.<\/p>\n
2. Bei Bakterien kann eine Vergiftung schneller nachgewiesen werden als bei Hefen.<\/p>\n
3. Reaktorkultivierungen zeigen w\u00e4hrend der exponentiellen Phase der OD auch ein exponentielles Ansteigen von ATP.<\/p>\n
Technische Komponenten
\nDie Hauptkriterien f\u00fcr die Realisierung des ATP-Biosensorsystems sind die Detektionszuverl\u00e4ssigkeit, die Signal-Sensitivit\u00e4t, die F\u00f6rderstr\u00f6me im FIA-System und eine m\u00f6glichst kleine Zeitspanne bis zum Messergebnis. Nur wenn die Vergiftung der Testkultur fr\u00fchzeitig festgestellt werden kann, ist es m\u00f6glich, die sch\u00e4dlichen Auswirkungen auf die Umwelt zu begrenzen. Deshalb wurde eine neue Messzelle mit Hintersp\u00fclung entwickelt und versucht, den Messwert mittels alternativer Auswerteverfahren schnell zu erkennen. Testfermentationen dienten der \u00dcberpr\u00fcfung der verschiedenen Kultivierungsphasen f\u00fcr Toxizit\u00e4tsmessungen. Als Ergebnisse konnte festgestellt werden:<\/p>\n
4. Das Mischungsverhalten und der Verbrauch an Reagenzien wurde durch Untersuchungen der F\u00f6rderstr\u00f6me optimiert.<\/p>\n
5. Die neue Messzelle mit Hintersp\u00fclung bewirkt eine Halbierung des Intervalls zwischen zwei Messungen auf etwa 20-25 min.<\/p>\n
6. Zwischen den Messgr\u00f6\u00dfen Plateauh\u00f6he, Anfangssteigung und dem Integral \u00fcber 3 min kann eine Beziehung hergestellt werden, die eine fr\u00fchzeitige Ergebnisdarstellung erm\u00f6glicht.<\/p>\n
7. F\u00fcr die Stabilit\u00e4t des immobilvisierten Luciferase-Enzyms ist es wichtig, dass der Messkopf gek\u00fchlt wird. Dadurch l\u00e4sst sich die Standzeit einer Membran auf etwa einen Monat verl\u00e4ngern. Die Reaktionszeit wird durch die K\u00fchlung praktisch nicht verl\u00e4ngert.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Das System wurde auf der DECHEMA Jahrestagung 1997 und der ACHEMA 1997 mit gro\u00dfer Resonanz pr\u00e4sentiert.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Verlauf des Projektes wurde ATP bei den im Antrag genannten Organismen gemessen und bei mehreren Mikroorganismen die hohe Aussagekraft des Stoffwechselsignals f\u00fcr die Wirkung verschiedener Toxine belegt. Zus\u00e4tzlich wurde ATP bei einer Kultur von Bacillus stearothermophilus TP 32, Micrococcus luteus und Ustilago maydis sowie einer Mischkultur von Belebtschlamm aus der \u00f6rtlichen Kl\u00e4ranlage in Donaueschingen nachgewiesen. Der Vielzahl und Unterschiedlichkeit der Organismen, an denen ATP gemessen werden konnte, zeigt, dass ATP ein universell messbares Signal f\u00fcr die Stoffwechselaktivit\u00e4t von Organismen ist und dass das weiterentwickelte Biosensorsystem direkt breit eingesetzt werden kann.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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