Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Beurteilung des kanzerogenen Risikos f\u00fcr die Bev\u00f6lkerung gewinnt immer gr\u00f6\u00dfere Bedeutung. F\u00fcr die Krebsentstehung relevante Stoffe, wie Nitrosamine, aromatische Amine und polycyclische Kohlenwasserstoffe stammen aus der Umwelt, daneben aber auch aus Pharmaka, Nahrungs- und Genu\u00dfmitteln. Das krebserregende Potential von Substanzen wird im Tierversuch ermittelt. Die fr\u00fchesten nachweisbaren Ver\u00e4nderungen nach Kanzerogenaufnahme sind die Bildung kovalenter Addukte an die DNA. Eines der sensitivsten Methoden zur Erfassung solcher Addukten stellt derzeit das 32P-Postlabeling dar. Die bisherigen Verfahren haben jedoch noch eine Reihe von M\u00e4ngeln, die den Einsatz f\u00fcr ein effektives Biomonitoring am Menschen stark einschr\u00e4nken. Eine entscheidende Verbesserung der bisher beschriebenen analytischen Methoden zu erreichen, ist das Ziel dieses Forschungsvorhabens.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie am h\u00e4ufigsten verwendeten Analysenverfahren wurden von uns vergleichend untersucht, mit dem Ziel die jeweiligen Schw\u00e4chen zu charakterisieren und zu wesentlichen Verbesserungen zu kommen. Hierzu wurde die DNA von Ratten und M\u00e4usen gewonnen, die zuvor mit Kanzerogenen, z.B. 4-Aminobi-phenyl, o-Toluidin, Benzo[a]pyren, behandelt worden waren. F\u00fcr die beiden erstgenannten Substanzen wurde das wichtigste DNA-Addukt synthetisiert um f\u00fcr die Chromatographie Vergleichsstandards zu bekommen. Nach Isolierung der DNA und Verdau zu den Mononukleotiden wurden folgende Verfahren zur Analyse der Addukte (ca 1 Addukt in 106 bis 1010 normalen Nukleotiden !) angewendet: Verdau mit Nuklease P1; Extraktion mit Butanol; Labeln mit ATP-Unterschu\u00df; Festphasenextraktion offline mit C18-und LMS-BondElut-S\u00e4ulchen und PEI (Polyethyleneimin), oder online in der HPLC-Anlage mit C18-S\u00e4ulen (Vors\u00e4ulenschalttechnik); die Analyse erfolgte wahlweise auf PEI-DC-Platten oder durch HPLC auf verschiedenen S\u00e4ulen, der Nachweis der radioaktiven Proben durch Phosphor-Image-Analyse (DC, HPLC-Blotting) oder online durch Radioaktivit\u00e4tsmonitoring. Als v\u00f6llig neues Verfahren wird das HPLC-Blotting entwickelt. Dabei wurde das HPLC-Flie\u00dfmittel nach der S\u00e4ule auf Filterpapier aufgetragen. Die aufgetragenen Bahnen des Filters wurden anschlie\u00dfend auf Radioaktivit\u00e4t untersucht.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Es hat sich gezeigt, da\u00df ein wichtiger Schritt in den meisten publizierten Analysenprotokollen, die Anreicherung der Nukleotid-Addukte, mit gro\u00dfen Verlusten verbunden ist. Dies gilt f\u00fcr die Anreicherung durch Butanol- oder offline Festphasenextraktion ebenso wie f\u00fcr den Verdau mit Nuclease P1. Andererseits belastet bei direktem Labeling mit anschlie\u00dfender HPLC-Analyse ein zu hoher Anteil normaler Nukleotide die Analyse. Au\u00dferdem wird bei diesem Verfahren mit einem Unterschu\u00df an radioaktivem ATP gelabelt. Dies f\u00fchrt zu nicht reproduzierbaren Ausbeuten und macht eine quantitative Analyse unm\u00f6glich. Deshalb m\u00fcssen dringend weitere Anstrengungen unternommen werden um die normalen Nukleotide reproduzierbar von den Addukt-Nukleotiden bereits vor dem Labeln abzutrennen.
\nDie reproduzierbare Trennung der Addukte durch HPLC ist ein ganz wesentlicher Vorteil gegen\u00fcber der D\u00fcnnschichtchromatografie. Allerdings ist die Nachweisempfindlichkeit im Radioaktivit\u00e4tsdetektor wegen der kurzen Z\u00e4hlzeiten begrenzt. Ein Peak ist maximal 2 min in der Durchflu\u00dfzelle, w\u00e4hrend die DC-Platte fast beliebig lang exponiert werden kann. Wir haben deshalb ein Blotting-Verfahren entwickelt, bei dem das HPLC-Eluat der HPLC-S\u00e4ule auf Zellulose-Platten aufgetragen wird. Die Radioaktivit\u00e4tsmessung kann dann in der gleichen Weise wie bei den DC-Platten durch Exposition von Fuji-Imaging Platten und Auswertung mit einem Fuji Bio-Imaging Analyzer vorgenommen werden. Dies h\u00f6ht die Nachweisempfindlichkeit um eine bis zwei Gr\u00f6\u00dfenordnungen. Durch die Beschichtung der Zellulose mit einem Ionenaustascher (1% PEI-L\u00f6sung) wird verhindert, da\u00df die Nukleotidaddukte mit dem HPLC-Eluat vom Auftragungsort wegdiffundieren und die Trennung der Peaks keine Einbu\u00dfen erleidet. Anhand von Leber-DNA von Ratten, die mit 4-Aminobiphenyl (4-ABP), o-Toluidin (OTD) und Benzo[a)pyren (BP) behandelt wurden, zeigte sich, da\u00df mit dieser Methode das HPLC-Chromatogramm nicht nur reproduziert, sondern auch eine Reihe von zus\u00e4tzlichen Addukten geringerer Intensit\u00e4t detektiert werden k\u00f6nnen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Mit Hilfe der DBU wurde im Dezember 1994 ein Workshop organisiert, an dem sich die meisten Arbeitsgruppen beteiligten, die sich in Deutschland mit dem 32P-Postlabeling besch\u00e4ftigen. Aufgrund des guten Erfolges dieses Workshops und der anschlie\u00dfenden gro\u00dfen Nachfrage der Teilnehmer wurde 1996 ein zweiter Workshop von Prof. Wie\u00dfler am DKFZ in Heidelberg ausgerichtet. Dabei wurden besonders die HPLC-Methoden ausf\u00fchrlich diskutiert. Der dritte Workshop 1997 in W\u00fcrzburg am Institut f\u00fcr Toxikologie, der von Prof. Eder ausgerichtet wurde, zeigte erneut, da\u00df HPLC-Methoden immer gr\u00f6\u00dferes Interesse finden. Im Rahmen eines HPLC-Seminars unter der Leitung von Prof. Ku\u00df, Abteilung Neurochemie der Psychiatrischen Klinik der LMU, konnten wir speziell unsere HPLC-Methode pr\u00e4sentieren und diskutieren. Unsere HPLC-Methode wurde ebenfalls dem Arbeitskreis: Untersuchung einer m\u00f6glichen Gesundheitsgef\u00e4hrdung durch berufliche Exposition gegen\u00fcber Zytostatika des Instituts f\u00fcr Arbeits-und Umweltmedizin vorgestellt. Au\u00dferdem wurden unsere bisherigen Ergebnisse auf einem internationalen Kongre\u00df in Kalifornien pr\u00e4sentiert. Nachfolgend sind die bisherigen Kurzver\u00f6ffentlichungen aufgef\u00fchrt. Au\u00dferdem ist zu diesem Thema bereits eine Diplomarbeit in Chemie abgeschlossen worden und eine Doktorarbeit steht kurz vor ihrem Abschlu\u00df.
\nNguyen PT Specht A Schulze J Richter E (1994) Entwicklung einer HPLC-Methode zum Nachweis von 32P-DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl. 32P-Postlabelling Workshop, Walther-Straub-Inst.f. Pharmakol. u. Toxikol., M\u00fcnchen, 2.-3.12.
\nNguyen P-T Specht A Richter E (1995) Detection of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with online HPLC enrichment. 6th Int Conf on Carcinogenic\/Mutagenic N-Substituted Aryl Compounds, Monterey, CA, 4.-8.11.1995
\nNguyen P-T Specht A Schwaiger U Richter E (1996) Improved determination of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with HPLC enrichment and blotting. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 353 (Suppl): R135
\nNguyen P.-T., Specht A. and Richter E. (1998) Improved detection of DNA adducts by 32P-Postlabeling with online HPLC enrichment and blotting, Carcinogenesis, submitted
\nSpecht A (1994) Bestimmung von DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl durch 32P-Postlabelling und HPLC. Diplomarbeit aus dem Fachgebiet Biochemie der Naturwissenschaftlichen Fakult\u00e4t der LMU<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, da\u00df das Verfahren des 32P-Postlabeling zum Nachweis der Belastung des Menschen mit kanzerogenen, umweltrelevanten Schadstoffen geeignet ist, wenn man sich die bessere Trennleistung der HPLC und die wesentlich erh\u00f6hte Nachweisempfindlichkeit durch die neuentwickelte Technik des HPLC-Blotting zunutze macht. Die von uns entwickelte Blottingmethode wird der HPLC-Analytik beim 32P-Postlabeling endg\u00fcltig zum notwendigen Durchbruch verhelfen. In Verbindung mit der S\u00e4ulenschalttechnik k\u00f6nnen Nachweisgrenzen erreicht werden, die denjenigen in der DC-Analytik um nichts nachstehen. F\u00fcr die kommerzielle Nutzung gilt es nun ein Blottingger\u00e4t zu entwickeln und einen Hersteller zu finden, der das PEI-beschichtete Filterpapier f\u00fcr die Anforderungen des Blotting optimiert. Wir sind zuversichtlich, da\u00df diese Methode dann in der Umweltanalytik f\u00fcr das Biomonitoring kanzerogener Substanzen breite Anwendung finden wird.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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