In der regulatorischen Toxikologie gibt es eine starke Nachfrage seitens der \u00d6ffentlichkeit und der Regierungen, Tierversuche aus ethischen Gr\u00fcnden zu ersetzen. Dar\u00fcber hinaus sollen alternative Testverfahren einen h\u00f6heren Testdurchsatz und somit eine umfassendere Pr\u00fcfung von Chemikalien erm\u00f6glichen, einschlie\u00dflich der vielen auf dem Markt befindlichen Chemikalien, f\u00fcr die keine Informationen zur Toxizit\u00e4t vorliegen. Ein alternatives Testverfahren ist die Verwendung so genannter “ungesch\u00fctzter” Lebensstadien, zu denen auch das Zebrafisch-Embryomodell geh\u00f6rt. Das Fischembryomodell bietet \u00e4hnliche Vorteile wie zellul\u00e4re Modelle wie z.B. kleiner Ma\u00dfstab und hoher Durchsatz, erm\u00f6glicht aber auch die Komplexit\u00e4t und Differenzierung eines in-vivo-Modells. Die Exposition von Zebrafischembryonen gegen\u00fcber Chemikalien kann zu unterschiedlicher Fehlbildungen f\u00fchren, deren Muster zur Diagnose der Wirkungsweise und zur Vorhersage von Gefahren dienen k\u00f6nnten. Mit Hilfe automatisierter Bildgebungs- und Bildanalyseroutinen ist eine unvoreingenommene, quantitativere Bewertung der Ph\u00e4notypen m\u00f6glich. Der Ansatz basiert auf der Verwendung einer am UFZ entwickelten Software (UFZ), die entsprechende Strukturen annotiert bzw. deren Koordinaten ermittelt. Auf der Grundlage dieser Koordinaten werden dann verschiedene Ma\u00dfe verwendet, um die Abweichung vom normalen Ph\u00e4notyp und die Effektkonzentrationen zu berechnen. Aufgrund der \u00c4hnlichkeit der Effektmuster kann eine Gruppierung von Chemikalien mit vermtlich \u00e4hnlichem Wirkungsmodus erfolgen. Allerdings ist derzeit nicht bekannt, inwieweit die Gruppierung von Chemikalien nach \u00c4hnlichkeit der Ph\u00e4notypen durch Unterschiede in der Toxikokinetik verzerrt werden kann. Chemikalien k\u00f6nnen je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften unterschiedlich schnell aufgenommen werden. Dies f\u00fchrt dazu, das zu unterschiedlichen Zeitpunkten Spitzen- oder Gleichgewichtskonzentrationen erreicht werden. Das Verst\u00e4ndnis des Zusammenhangs zwischen Toxikokinetik und Ph\u00e4notypen ist daher von entscheidender Bedeutung, wenn man Wirkungsmuster f\u00fcr die Klassifizierung von Substanzen nutzen will.<\/p>\n
Mein erstes Ziel ist es, die Erfassung der Ph\u00e4notypen durch eine weitere Optimierung der morphologischen Analyse (z. B. durch Einbeziehung zus\u00e4tzlicher Endpunkte) zu verbessern und die Quantifizierung und Konzentrations-Wirkungs-Analyse st\u00e4rker zu automatisieren. Mit Hilfe dieser verbesserten Protokolle zur Bewertung des Ph\u00e4notyps beabsichtige ich, die Auswirkungen der Toxikokinetik anhand einer Reihe von Verbindungen (z. B. COX-Hemmer, Hemmung von Natrium- und GABA abh\u00e4nigen Kan\u00e4len in Nerven) mit bekannterma\u00dfen \u00e4hnlicher Wirkungsweise zu analysieren. Schlie\u00dflich werde ich eine Strategie zur Ber\u00fccksichtigung von Unterschieden in der Toxikokinetik bzw. im Expositionsfenster entwickeln, um eine vergleichende Bewertung der ph\u00e4notypischen Wirkungsmuster zu erm\u00f6glichen. Parallel zur Wirkungsanalyse sollen interne Konzentrationen gemessen werden, um die beobachteten Wirkungen mit den internen Konzentrationszeitverl\u00e4ufen in Beziehung zu setzen.<\/p>\n
Bislang wurden zwei Verbindungen nach den oben genannten Kriterien ausgew\u00e4hlt: Acetylsalicyls\u00e4ure und Valproins\u00e4ure. F\u00fcr die beiden Chemikalien wurden verschiedene Expositionsszenarien auf der Grundlage des standardm\u00e4\u00dfigen 4-Tage-Toxizit\u00e4tstests f\u00fcr Fischembryonen erstellt. Im Falle von Acetylsalicyls\u00e4ure wurden zun\u00e4chst drei kurzfristige Expositionsfenster (2-4, 2-6 und 2-8 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) verwendet, nach denen die Exposition gestoppt wurde und die Embryonen f\u00fcr den Rest der Testperiode in Wasser gehalten wurden. Durch die Verwendung von Kurzzeitexpositionen sollte die interne Exposition auf einen bestimmten Zeitraum begrenzt werden, da die Abgabe von Chemikalien aus Fischembryonen in das Inkubationsmedium relativ schnell erfolgt. Dies erfordert relativ hohe Konzentrationen, erm\u00f6glicht aber eine Absch\u00e4tzung, ob die Exposition w\u00e4hrend verschiedener Entwicklungsperioden das Ausma\u00df und\/oder das Muster der Auswirkungen ver\u00e4ndern kann. Es erwies sich jedoch als schwierig, Effekte bei diesen sehr kurzen Expositionszeitfenstern hervorzurufen. Im Falle von Valproins\u00e4ure wurde daher eine alterative Strategie verwendet. Und zwar wurden der Expositionsstartpunkt (von 2 -10 h nach der Befruchtung) variiert, die Exposition aber bis zum Tag 4 der Entwicklung fortgesetzt. Die morphologischen und verhaltensbezogenen Wirkungen wurden w\u00e4hrend der Expositionsversuche bewertet.<\/p>\n
Die Vertebrate Automated Screening Technology (VAST, Union Biometrica) und der Automated Imaging Robot (AIR, Life Science Methods) erm\u00f6glichten eine pr\u00e4zise und automatisierte Positionierung von Embryonen und wurden f\u00fcr eine automatisierte Ph\u00e4notyp-Bewertung verwendet. Die Bewertung des Ph\u00e4notyps basierte auf der Verwendung von 2D-Bildern (lateral, dorsoventral) ausgew\u00e4hlter Stadien und der Identifizierung von Koordinaten morphologischer Strukturen mit Hilfe von Deep Learning-basierten Erkennungsmodellen. Zur Visualisierung bestimmter Strukturen, wie z. B. Blutgef\u00e4\u00dfe, wurden Subtraktionsbilder von Videobildern verwendet werden. Die in der Software KNIME \u00a0entwickelten Workflows berechneten automatisch Metriken wie K\u00f6rperl\u00e4nge, Augengr\u00f6\u00dfe, Gehirnvolumen, Otolithen-Augen-Abstand und Pigmentierungsintensit\u00e4t. Durch den Vergleich mit den Metriken von Kontrollembryonen wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven modelliert und zur Absch\u00e4tzung von Effektkonzentrationen f\u00fcr einzelne Metriken verwendet.<\/p>\n
Neben der morphologischen Analyse wurden auch Verhaltenseffekte mit Hilfe des ZebraBox-Systems und der zugeh\u00f6rigen ZebraLab-Software (ViewPoint Behavior Technology) bewertet. Es wurden drei verschiedene Methoden angewandt, um die potenziellen toxischen Auswirkungen auf das Verhalten von Zebrafisch-Embryonen\/Larven zu bewerten: Spontane Schwanzkontraktion (STC), Photomotorische Reaktion (PMR) und Lokomotorische Reaktion (LMR).<\/p>\n
Es ist vorgesehen, auch die internen Konzentrationen der exponierten Zebrafisch-Embryonen zu analysieren.<\/p>\n
Auf der Grundlage der ph\u00e4notypischen Analyse wird erwartet, dass mindestens 20 morphologische Merkmale sowohl f\u00fcr laterale als auch dorsoventrale Bilder berechnet werden k\u00f6nnen. Dies wird zu recht komplexen Datens\u00e4tzen f\u00fchren, die mit Hilfe etablierter statistischer Methoden weiter analysiert werden.<\/p>\n
Beide Chemikalien verursachten morphologische Ver\u00e4nderungen im angewandten Konzentrationsbereich in beiden Expositionsfenstern. Die morphologischen Daten werden fortlaufend analysiert, um diese Fehlbildungen zu quantifizieren und Konzentrations-Wirkungsbeziehungen abzuleiten. Acetylsalicyls\u00e4ure hatte bei keiner der angewandten Konzentrationen einen Einfluss auf die im LMR-Test zur\u00fcckgelegte Strecke. STC- und PMR-Tests wurden mit dieser Chemikalie noch nicht durchgef\u00fchrt.\u00a0 Valproins\u00e4ure verringerte die im LMR-Test zur\u00fcckgelegte Strecke in beiden Expositionsgruppen mit Ausnahme der kleinsten angewandten Konzentrationen. Sie erh\u00f6hte die Anzahl der spontanen Schwanzkontraktionen im STC-Test bei allen angewandten Konzentrationen in beiden Expositionsgruppen. Im PMR-Test verringerte Valproins\u00e4ure die Erregung der Larven in einer konzentrationsabh\u00e4ngigen Weise in der 2 hpf-Expositions-Gruppe, w\u00e4hrend dieser R\u00fcckgang in der 10 hpf-Gruppe weniger deutlich war.<\/p>\n
In den n\u00e4chsten Phasen des Forschungsprogramms werde ich weiterhin verschiedene Expositionstests mit neuen Modellverbindungen und unterschiedlichen Expositionsszenarien durchf\u00fchren, um gen\u00fcgend Daten zu sammeln, um die Rolle der Toxikokinetik bei der vergleichenden Analyse von Chemikalien unter Verwendung ph\u00e4notypischer Wirkungsmuster zu untersuchen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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