The impact of nanomaterials on Tetrahymena thermophila1. EinleitungKatecholamine (Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin) sind Neurotransmitter, die nicht nur bei S\u00e4ugetieren gefunden werden k\u00f6nnen, sondern auch in unicellularen Protozoen wie Tetrahymena thermophila [1]. Diese Monoamine spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung und der Kooperation der Aktivit\u00e4ten von spezialisierten Zellen. Viele Studien haben best\u00e4tigt, dass die Hom\u00f6ostase von Katecholaminen gest\u00f6rt werden kann und hohe Konzentrationen von Dopamin bis zum Zelltod f\u00fchren k\u00f6nnen [2]. In der vorliegenden Studie werden die Auswirkungen von Nanomaterialien (nC60 Fulleren, C60(OH)24 Fullerenol) auf Katecholamine im Protozoon Tetrahymena thermophila untersucht. Die Ver\u00e4nderungen der Konzentrationen von Katecholaminen wurden mittels HPLC – ECD bestimmt. Um die m\u00f6gliche Proliferation und Nekrose der Zellen zu identifizieren, wurden Resazurin – und Propidiumiodid – Assays durchgef\u00fchrt, die jeweils die metabolische Aktivit\u00e4t [3] und Membranintegrit\u00e4t [4] kontrollieren sollten.Schlagworte : Tetrahymena thermophila; Katecholamin-Hom\u00f6ostase, Nanomaterialien, HPLC-ED; Resazurin; Propidiumiodid; Zellvitalit\u00e4tsbestimmung.2. Material und Methoden2.1. T. thermophila KulturenT. thermophila wurde in 40 ml Proteose Pepton Hefeextrakt-Medium (PPY) kultiviert. Um eine Vorratskultur von T. thermophila zu erzeugen, wurden 250 \u00b5l einer Langzeitstammkultur in 40 ml frisches, steriles Medium, das PPY, Penicillin G, Amphotericin B und Dihydrostreptomycin-sesquisulfat enthielt, \u00fcbertragen und bei 28 \u00ba C Grad \u00fcber das Wochenende inkubiert. Zur Vorbereitung der Kulturen f\u00fcr Tests wurden 5 ml aus der Vorratskultur in 40 mL steriles PPY in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben \u00fcbertragen und im Brutschrank bei 28 \u00b0 C Grad 1-2 Tage angezogen. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und zweimal mit Osterhout Medium gewaschen. Danach wurden die Zellen in 40 – 50 ml Osterhout Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Z\u00e4hlkammer gez\u00e4hlt.2.2. Vorbereitung von C60, C60 (OH)24 und Ru\u00df20 mg C60-Fulleren-Pulver wurden in 20 ml Toluol mit einem Magnetr\u00fchrer gel\u00f6st. Nach Zugabe des Toluols erschien die C60-Toluol Stamml\u00f6sung als violett gef\u00e4rbt und wurde in ein Becherglas mit 50 ml Osterhout Medium und 1, 5 ml Ethanol \u00fcberf\u00fchrt. Die Mischung wurde mit einer Ultraschalltauchsonde bei ca. 70 W f\u00fcr 4 Stunden beschallt, bis die Toluol-Phase verschwunden war. Die nun gelblich-braune Dispersion wurde durch einen 0,7-\u00b5m Glasfaserfilter filtriert und im K\u00fchlschrank aufbewahrt. Die Konzentration des w\u00e4ssrigen nC60 wurde mit einem Spektrophotometer bestimmt. Wasserl\u00f6sliches C60(OH)24 wurde in Osterhout Medium vorbereitet. 3,8 mg C60(OH)24 Pulver wurden in 250 ml Osterhout-Medium aufgel\u00f6st. Hydrophober Ru\u00df (Carbon Black, Printex 90), 5 mg, wurde auf 100 ml Osterhout Medium gegeben und f\u00fcr 30 Minuten im Ultraschallbad beschallt, um die Partikel zu dispergieren.2.3. Katecholamine Hom\u00f6ostase in T. thermophila\tDer Einzeller Tetrahymena thermophila wurde in 24 \u0096 well (3 mL) Mikrotiterplatten f\u00fcr 24 und 48 h inkubiert. Die Dichte der Zellen belief sich auf 8,5 x 105 Zellen \/ ml Osterhout-Medium. Von beiden Nanomaterialien nC60 und C60(OH) 24 wurden je 1 mL in der gleichen Konzentration (15,5 ppm) zu den Zellen hinzugef\u00fcgt. Nach der Inkubationszeit wurden 1,5 ml der Zellen (1,7 x 106 cells\/ml) aus jedem Well zur Festphasenextraktion (SPE-Kartusche) entnommen. Das Verfahren wurde der Herstellervorschrift (ClinRep \u00ae HPLC Komplett-Kit, Recipe, M\u00fcnchen, Deutschland) nachempfunden. Die Technik besteht aus 3 Schritten: Extraktion, Waschen und Elution. Zur Extraktion werden 1,5 ml der Zellen, 1,4 ml Tris-Puffer und 200 \u00b5l Na2S2O7-L\u00f6sung wurden in Nunc Zentrifugenr\u00f6hrchen gegeben und mit einer Ultraschalltauchsonde (Bandelin Sonopuls GM 70, Deutschland) bei 10 Zyklen \u00e0 20 Sekunden die Zellen lysiert. Danach wurden 400 \u00b5l des Internen Standards DHBA zu allen Proben gegeben und f\u00fcr 2 Minuten bei 3000 U\/min zentrifugiert. Der \u00dcberstand der zentrifugierten Proben wurde mit einer 2,5 ml Spritze entnommen. Die Proben wurden durch ein 1 \u00b5m Filter in die SPE Kartusche f\u00fcr Katecholamine (RECIPE \u00ae) gefiltert, die 22 mg spezielles Al2O3 in 0,5 ml 2M Tris-Puffer enth\u00e4lt. Alle SPE-Kartuschen wurden f\u00fcr 15 Minuten gevortext, um die Katecholamine an die Oberfl\u00e4che des Al2O3 zu binden. Die fl\u00fcssige Phase der Proben wurde auf einer Vakuum\u0096SPE- Kammer (Supelco TM visiprep DL, USA) entfernt. Anschlie\u00dfend wurden die Proben 3-mal mit je 1 ml Waschl\u00f6sung gewaschen und danach mit Vakuum leergesaugt. 160 \u00b5L einer Elutionsl\u00f6sung (Recipe) wurde auf jede SPE-Kartusche \u00fcbertragen und an deren Ausgang kleine PP-Elutionsr\u00f6hrchen unter Verwendung von Parafilm befestigt. Die SPE- Kartuschen wurden f\u00fcr 10 Minuten gevortext und dann f\u00fcr 4 min bei 2000 U \/ min zentrifugiert. Anschlie\u00dfend, wurden die Proben in PP-HPLC-Vials \u00fcberf\u00fchrt und mittels HPLC-ECD analysiert. Die HPLC-ECD – Anlage bestand aus einer GP40 Gradientenpumpe, ED 40 elektrochemischem Detektor mit eingestelltem Potential von + 0,7 V gegen Ag \/ AgCl und einem ACS50 Autosampler (Dionex Corporation, 1228 Titan Way, Sunnyvale, CA). Als Chromatographies\u00e4ule wurde “Clin Rep \u00ae Katecholamine in Plasma (Recipe)” verwendet. Es erfolgt eine isokratische Chromatograpie mit \u0084Mobiler Phase f\u00fcr Katecholamin Analytik\u0093 (Recipe) bei einer Flussrate von 1 ml\/min u. 30 \u00ba C bis zu eine Laufzeit v. 15 Minuten.2.4. Zellvitalit\u00e4tsbestimmung auf Tetrahymena thermophilaDie Exposition von T. thermophila wurde in 24 well Mikrotiterplatten f\u00fcr 6h, 24 h und 48 h durchgef\u00fchrt. Zun\u00e4chst wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 5min), 2-mal mit Osterhout – Medium gewaschen und in der Z\u00e4hlkammer gez\u00e4hlt. Die Dichte von Tetrahymena thermophila Kulturen wurde mit Osterhout Medium angepasst, um mindestens 10 5 Zellen in 487, 8 \u00b5L zu erhalten. Unterschiedliche Konzentration von nC60, C60(OH)24 (1,94, 3,88, 7,75 und 15,5 ppm) und Carbon Black (6,25, 12,5, 25 und 50 ppm) wurden in die 24 Well Mikrotiterplatten transferiert, die 487, 8 \u00b5L\/Well der Zellen enthielten. Unbehandelte Zellen wurden als Kontrollgruppe verwendet. Alle Proben wurden in 4 Wiederholungen vorbereitet. Nach der Einwirkzeit (6h, 24 h und 48 h) wurden 100 \u00b5l aus jeder Vertiefung der 24iger Mikrotiterplatten in schwarze und transparente 96 Polypropylen – Mikrotiterplatten f\u00fcr die Zellvitalit\u00e4tsbestimmung \u00fcbergeben. Schwarze 96-Well-Platten wurden f\u00fcr Propidiumiodid und transparente 96-Well-Platten f\u00fcr Resazurin verwendet. 20 \u00b5L des Propidiumiodid wurde in die schwarzen 96-Well-Platten gegeben und 50 \u00b5L des Resazurin wurden in die transparenten 96 Well-Platten \u00fcbertragen. Zun\u00e4chst wurden die Platten mit dem Sch\u00fcttler f\u00fcr 2 Minuten bewegt und dann 30 Minuten bei 28 \u00ba C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Messung unter Verwendung eines Fluoreszenz Mikroplatten-Readers bei Wellenl\u00e4ngen von 535 nm (Anregung), 590 nm (Emission) f\u00fcr beide Fluoreszenzfarbstoffe.3. Ergebnisse Die Katecholamin-Analyse mittels HPLC-ECD in Tetrahymena thermophila ergaben hohe Dopaminspiegel in der Kontrollgruppe und der Gruppe, die Nanomaterialien ausgesetzt war (Abb. 2 b, c, d und Tab.1). Die h\u00f6chste Dopaminmenge wurde in Tetrahymena -Zellen erkannt, die auf nC60 Fulleren (2461, 75 pg \/ mL) und nC60(OH)24 Fullerenol (2223,58 pg \/ mL) in 1,7 x 106 Zellen \/ ml ausgesetzt werden. Die h\u00f6chsten Noradrenalinmengen erschienen in den Zellen, die mit nC60(OH)24 behandelt wurden, und die niedrigste Menge wurde in der Kontrollgruppe pr\u00e4sentiert (unbehandelte Zellen). Das Adrenalin wurde in den Zellen in kleinsten Mengen (Tab. 1) entdeckt. Die Verweilzeit der Tetrahymena – abgeleitet Katecholamine stimmte mit authentischen Standards, damit weitere Annahme, dass die Identifikationen richtig waren. Die Standardabweichungen f\u00fcr alle Katecholamine in der Kontrollgruppe waren unterschiedlich im Vergleich mit Katecholaminen in den behandelten Zellen. Der Variationskoeffizient reichte von 0, 19% (unbehandelte Zellen) bis zu 11, 90% (behandelte Zellen). F\u00fcr alle Proben wurden Wiederfindungen im Bereich von 40 bis 68% gefunden (Tabelle II). Die Fluoreszenzfarbstoffe (Propidiumiodid und Resazurin) zeigt Reduzierung der Lebensf\u00e4higkeit der Zellen bei geringen Konzentrationen (1, 94 und 3, 88 ppm) von nC60 und C60(OH)24. Je l\u00e4nger die Expositions-Zeit gegen\u00fcber den Nanomaterialien, desto h\u00f6here Toxizit\u00e4t und damit weniger Zelllebensf\u00e4higkeit wurde mit den beiden Farbstoffen (Abb.3.A und B) identifiziert. Es gab keine Unterschiede in Zell-Antworten f\u00fcr beide Farbstoffe bei h\u00f6herer Konzentrationen von Nanomaterialien (7,75 und 15,5 ppm). Fullerenol C60(OH)24 erscheint mehr toxisch f\u00fcr die Zellen als Fulleren nC60, was sich durch erh\u00f6hte Werte f\u00fcr PI und erniedrigte Werte f\u00fcr AB RFU Werte ausgedruckt (Abb.3.A und B). Der h\u00f6chste Verlust der Lebensf\u00e4higkeit im Vergleich zu nicht – behandelten Zellen wurde durch C60(OH) 24 nach 24 Stunden Exposition verursacht. Der Verlust von Lebensf\u00e4higkeit der Zellen wurde in Gegenwart von Carbon Black nach 6 h Inkubation beobachtet, was mit h\u00f6heren RFU-Werten f\u00fcr Propidiumiodid korreliert. Die Ergebnisse f\u00fcr die Zellentwicklungsf\u00e4higkeitsanalyse mit Resazurin in allen Proben unterschieden sich nicht signifikant untereinander (Abb. 3 A, B, C).4. Diskussion Das Ziel der aktuellen Studien ist es, die Auswirkungen von Nanomaterialien auf bestimmte Organismen am Beispiel von Tetrahymena thermophila zu bewerten. Zusammen mit dem immer verbreiteteren Umgang mit Nanomaterialien, wachsen die Bedenken vor den sch\u00e4dlichen Nebenwirkungen von Nanomaterialien. In dieser Arbeit wurde Katecholamin-Hom\u00f6ostase und die m\u00f6gliche Proliferation und Nekrose der Einzeller untersucht. Zusammenfassend l\u00e4sst sich aus den beiden durchgef\u00fchrten Studien schlussfolgern, dass das Fulleren nC60 und das Fullerenol nC60(OH) 24 in einer Konzentration bei 15,5 ppm die zunehmende Bildung von Katecholaminen verursacht. Weiter wurde ein Verlust der Zelllebensf\u00e4higkeit in geringeren Konzentrationen (1,94 und 3,88 ppm) mit den beiden Nanomaterialien ermittelt. Die geringere Toxizit\u00e4t in h\u00f6heren Konzentration des Nanomaterialien l\u00e4sst sich dadurch erkl\u00e4ren, dass Tetrahymena ein Partikel fressender Organismus ist. Seine Vakuolen kann die Nanopartikel unterschiedlich gut aufnehmen. In anderen Worten, dieser Organismus scheint durch die Aufnahme und Speicherung die sch\u00e4dlichen Nanopartikel zu sequestrieren und damit deren Toxizit\u00e4t zu reduzieren[5, 6, 7]. Zwar ist es bekannt, dass h\u00f6here pathologische Dopaminspiegel umgekehrt zu indirektem oxidativen Stress durch die Bildung von Dopamin-Oxidationsprodukten f\u00fchren k\u00f6nnen [8], dennoch m\u00fcssen die weitere Studien beweisen, dass Nanomaterialien direkt die Katecholamin-Hom\u00f6ostase st\u00f6ren. Es erscheint erforderlich, entsprechende Untersuchungen nicht nur in der logarithmischen Wachstumsphase von Tetrahymena, sondern auch in fr\u00fchen und sp\u00e4ten station\u00e4ren Phase durchzuf\u00fchren.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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