Entwicklung eines Real-Time-PCR-VerfahrensProblemstellung der Forschungsarbeit:In der Trinkwasserversorgung sind f\u00fcr den Beh\u00e4lter- und Rohrleitungsbau Metalle und mineralische Werkstoffe gebr\u00e4uchlich. Zum Korrosionsschutz kamen zus\u00e4tzlich schon fr\u00fch Beschichtungen mit organischen Werkstoffen auf, die in der Folgezeit durch Neuentwicklungen um verschiedene Stoffgruppen erweitert wurden.Im Zuge der Anwendung solcher Beschichtungen und Auskleidungen von Beh\u00e4ltern und Leitungen wurde eine Zunahme der Bakterienzellzahl im Wasser beobachtet. Die Verkeimungen – festgestellt als Koloniezahlerh\u00f6hung – kamen dadurch zustande, da\u00df organische niedermolekulare Verbindungen aus der Beschichtung einen mikrobiellen Bewuchs (Biofilm) f\u00f6rdern, von dem die Bakterien in das freie Wasser \u00fcbergingen. Die Ausbildung von Biofilmen im Trinkwasser ist nicht zu tolerieren, da Biofilme ein potentielles Habitat f\u00fcr unerw\u00fcnschte oder pathogene Mikroorganismen sein k\u00f6nnen. Um eine mikrobielle Beeintr\u00e4chtigung des Trinkwassers durch Materialien auszuschlie\u00dfen, d\u00fcrfen im Trinkwasser nur solche Werkstoffe eingesetzt werden, die im Kontakt mit Wasser nicht zu einer Vermehrung von Mikroorganismen f\u00fchren.Allen Verfahren ist zu eigen, da\u00df Me\u00dfzeiten von mehreren Monaten ben\u00f6tigt werden bis eine Aussage \u00fcber das Wachstum von Mikroorganismen auf den getesteten Materialien gemacht werden kann. Hinzu kommt, da\u00df die Quantifizierung mit diesen Verfahren z. T. schwierig ist und bei der Methode nach W270 es zu Fehlmessungen durch nicht-biologische Ablagerungen auf dem Testmaterial kommen kann. In der vorliegenden Projektskizze wird die Entwicklung eines molekularbiologischen Verfahrens beschrieben, das mikrobiellen Bewuchs von Materialien im Trinkwasser-gebrauch quantitativ analysiert und in 4 Wochen Ergebnisse liefern soll, die eine Be-wertung von Materialien erlaubt.Das Ziel:Ziel des Vorhabens ist es, eine real-time PCR-Methode (RT-PCR) zu entwickeln, die den Bewuchs von Materialien im Trinkwasser durch Mikroorganismen innerhalb von 4 Wochen quantitativ bestimmen kann. Es ist beabsichtigt, das Verfahren so auszulegen, da\u00df sowohl der Nachweis von Prokaryonten als auch eukaryontische Mikro-organismen\/Parasiten m\u00f6glich ist. Angaben zur Vorgehensweise und Methoden:Der Nachweis von Bakterienwachstum auf Materialien im Trinkwasser durch RT-PCR soll an Kunststoffen etabliert werden, die bereits mit dem Verfahren W270 \u00fcberpr\u00fcft wurden. Die Testmaterialien werden wie in dem Verfahren W270 beschrieben in ein Testbecken eingebracht und mit Trinkwasser umsp\u00fclt. Dies bietet den Vorteil, da\u00df mit der nat\u00fcrlichen Mikroorganismenpopulation des Trinkwassers getestet wird. Zur Untersuchung mit RT-PCR werden die zu testenden Kunststoffteile mit definierter Gr\u00f6\u00dfe direkt in die PCR-Reaktionsgef\u00e4\u00dfe \u00fcberf\u00fchrt, mit Ultraschall behandelt und f\u00fcr 15 min auf 94\u00b0 C in der PCR-Maschine erhitzt, so da\u00df die Zellen lysieren und die DNA freigesetzt wird. Alternativ kann von einer definierten Fl\u00e4che des Kunststoffs die Zellen der Prim\u00e4rbesiedelung abgenommen und in das Reaktionsgef\u00e4\u00df f\u00fcr die PCR-Untersuchung \u00fcberf\u00fchrt werden. Die RT-PCR wird mit universellen Primern nach Rivas et al. (2004) durchgef\u00fchrt, die die Amplifikation der 16S-RNA-Gene aus Prokaryonten und der 18S-RNA-Gene aus eukaryontischen Mikroorganismen erlaubt. Der Nachweis der gebildeten DNA erfolgt mit Hilfe des Farbstoffs SYBR-Green. Die Zellzahl wird \u00fcber relative Quantifizierung bestimmt. Im Vergleich mit verschieden konzentrierten Standards definierter Zellzahl kann die Zellzahl im Testansatz ermittelt werden. Die direkte Verwendung von Bakterien (Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum) als Standard im PCR-Ansatz wird an DNA-Standards unterschiedlicher Konzentration, die aus Zellen definierter Zahl isoliert wurde, \u00fcberpr\u00fcft. Des weiteren mu\u00df sichergestellt werden, da\u00df eine Vielzahl verschiedener Zelltypen durch Ultraschall und Hitzeinkubation lysiert werden und die freigewordene DNA durch PCR amplifizierbar ist. Als Modellorganismen werden E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus niger getestet. Praktische Anwendung:Das RT-PCR-Verfahren zur Materialuntersuchung im Trinkwasser wird mit dem Ziel entwickelt, die bisherigen Testmethoden in der praktischen Anwendung zu ersetzen und ein Verfahren an die Hand zu bekommen, das die klassischen Methoden als normative Verfahren ersetzen soll.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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