Motivation:

Mineralölkohlenwasserstoffe (MKWs), polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs), polychlorierte Biphenyle (PCBs) und Biarylether gehören zu den bedeutendsten organischen Umweltschadstoffen. Ein wesentlicher Faktor des schädigenden Potentials dieser Verbindungen ist ihre Persistenz, welche unter anderem durch ihre außerordentlich schlechten Wasserlöslichkeit begründet ist. Die damit verbundene schlechte Bioverfügbarkeit erschwert den Abbau dieser organischen Schadstoffe durch Bodenmikroorganismen. Um sich diese Verbindungen trotzdem als Kohlenstoffquelle nutzbar zu machen, verfügen manche Mikroorganismen über Strategien zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit. Eine solche Strategie ist die Produktion von amphiphilen, ober- und grenzflächenaktiven Verbindungen. Durch die Freisetzung dieser Biotenside sind Bakterien in der Lage die Grenzflächenspannung zwischen den organischen Verbindungen und dem umgebenden Wasser herabzusetzen und so unter anderem die Emulsionsbildung zu begünstigen. Bleiben die Biotensidmoleküle an die Bakterienzellwand assoziiert, so bietet sich für die Bakterien die Möglichkeit der Anlagerung an die hydrophoben Schadstoffe. Die verbreitetste Gruppe von Biotensiden sind die Glycolipide. Sie bestehen aus Zucker- und Fettsäurebausteinen. Verglichen mit synthetischen Tensiden, verfügen die Biotenside über sehr gute tensidspezifische Kenndaten, wie z. B. eine in der Regel niedrigere kritische Micellbildungskonzentration (cmc). Darüber hinaus sind sie schnell biologisch abbaubar und weit weniger toxisch als die synthetischen Tenside. Diese Eigenschaften favorisieren Biotenside für den Einsatz sowohl bei umwelttechnologisch relevanten Prozessen, wie der Altlastensanierung oder Ölschadensbekämpfung, als auch bei der Lebensmittelveredlung oder in den anspruchsvollen high-cost Anwendungen der Pharmazie und der Kosmetik. Einem großtechnischen Einsatz der Biotenside stehen allerdings noch die hohen Produktionskosten im Weg, welche unter anderem in teuren Aufreinigungsprozessen begründet liegen. Zur Verbesserung der bislang nicht gegebenen Wettbewerbsfähigkeit der Biotenside ist eine Vertiefung der Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Biotensidsynthese erforderlich. Ein besseres Verständnis der Biosynthese bildet wiederum die Grundlage für die Konstruktion leistungsfähiger Produktionsstämme. Diese Kenntnisse fehlen bisher weitgehend für Trehaloselipide, eine Gruppe neutraler und anionischer Glycolipide, welche von Rhodococcen und anderen Vertretern der Actinomyceten vornehmlich bei Wachstum auf Alkanen gebildet werden. Nichtionische Trehaloselipide zeigen ein hervorragendes Emulgationsverhalten für Kohlenwasserstoffe und wurden in der Vergangenheit bereits erfolgreich in Pilotstudien zur Ölschadensbekämpfung und „Microbial Enanced Oil Recovery“ eingesetzt.



Problemstellung:

Der Nachweis einer Beteiligung von Genen der Trehalose-6-phosphat-Synthase (otsA) und der Enoyl-Acylcarrierprotein-Reduktase (inhA) an der Trehalosedicorynomycolatsynthese soll durch Detektion auf Protein- und mRNA-Ebene zu definierten Zeiten des Wachstums bzw. der Biotensidbildung von Rhodococcus opacus 1CP geführt werden. Es ergibt sich dabei die Notwendigkeit der Aufzeichnung des Wachstumsverhaltens von Stamm 1CP während der Biotensidbildung. Dies ist im Gegensatz zum Wachstum auf löslichen Substraten nicht durch klassische Trübungsmessungen möglich. Während der Kultivierung von Rhodococcus opacus 1CP auf langkettigen Alkanen kommt es aufgrund der Wasserunlöslichkeit der Substrate zur Aggregation von Zellen und zur Entstehung von Substrat/Öl-Partikeln. Diese Inhomogenitäten verhindern eine photometrische Kontrolle des Wachstumsverlaufes ebenso wie eine reproduzierbare Probennahme zur Biomassebestimmung.

Lösungsansatz:

Statt der photometrischen Kontrolle des Wachstumsverlaufes sollen im Rahmen des Projekts kalorimetrische Methoden zur Bestimmung des Wachstumszustandes eingesetzt werden. Die Kalorimetrie erlaubt im Gegensatz zu den photometrischen Methoden prinzipiell uneingeschränkt die Aufzeichnung des Metabolismus unterschiedlichster Zellkulturen. Die Wärmeleistung ist dabei proportional zum physiologischen Zustand der Kultur. Weitere Vorteile der Kalorimetrie sind der nicht-invasive Charakter der Methode sowie die zeitnahe, kontinuierliche Messwerterfassung.
Mit Hilfe kalorimetrischer Methoden soll das Wachstumsverhalten von Rhodococcus opacus 1CP auf n-Alkanen reproduzierbar verfolgt werden. Nachfolgende regulatorische Untersuchungen sollen Hinweise auf die Auswirkung unterschiedlicher Kultivierungsparameter auf die Biotensidausbeute liefern. Dies ermöglicht eine Optimierung der Kulturbedingungen hin zu einer möglichst hohen Trehaloselipidausbeute. Zur Festlegung eines günstigen Erntezeitpunktes werden kalorimetrisch überwachte Ansätze zu definierten Zeitpunkten abgebrochen und hinsichtlich ihres Biomasse/ Biotensid-Verhältnisses bestimmt.
Für den Nachweis der Beteiligung von Trehalose-6-phosphat-Synthase OtsA und Enoyl-ACP-Reduktase InhA an der Biotensidbildung erfolgt die Untersuchung der erhaltenen Biomasse zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums auf Protein- und mRNA-Ebene hinsichtlich der Expression beider Enzyme. Zum Einsatz kommen hierzu klassische Methoden der 2D-PAGE bzw. der rTPCR und der RNA/DNA- Hybridisierung.